技術丨PCR實驗室輔料質檢
來源: 小桔燈網 作者: 原博士 2020年12月01日 10:15
在之前的文章中已經探討了擴增試劑、PCR儀、提取試劑乃至采樣拭子的評價方式。今天我們繼續探討PCR實驗室最容易忽視的環節,對試驗輔料進行質檢。PCR實驗室的輔料指的是PCR實驗中常用的一些輔助試劑和耗材,比如采樣管、拭子、離心管、PCR管、吸頭、移液器、無核酸酶水和試管架等。

技術丨PCR實驗室輔料質檢


在之前的文章中已經探討了擴增試劑、PCR儀、提取試劑乃至采樣拭子的評價方式。今天我們繼續探討PCR實驗室最容易忽視的環節,對試驗輔料進行質檢。PCR實驗室的輔料指的是PCR實驗中常用的一些輔助試劑和耗材,比如采樣管、拭子、離心管、PCR管、吸頭、移液器、無核酸酶水和試管架等。


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輔料質檢的基本原則


輔料的質檢通常是在新一批的輔料到實驗室后統一做一次或者定期(半年或1年)做,因此質檢就包含了驗貨和質檢2個部分。由于輔料的質檢沒有一個統一的標準,一般由各實驗室自行制定,可簡可繁,這里提出一些方法供大家參考和批評指正。

1.外包裝檢查:外包裝應完整無損無污,標識清楚,檢查品名、品牌,貨號,規格、生產日期,有效期、保存條件等信息。

2.內包裝檢查:內包裝物品應與外包裝標識一致,檢查是否有破損,泄漏,內容物是否齊全,是否有相應的使用說明書等

3.性能質檢:檢測試劑耗材是否與其性能一致,比如吸頭的準確性和氣密性等

4.污染物質檢:檢測試劑耗材是否被常規檢測項目的待檢物污染,這種污染可能是物品生產環節,也可能是運輸或實驗室的保存過程中被污染。

5.抑制物質檢:檢測試劑耗材中是否存在PCR反應的抑制物,比如核酸酶。


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輔料質檢的前提條件


1.弱陽性質控:需要準備弱陽性質控,包括標準物質、第三方質控或弱陽性樣品用于進行性能質控和抑制物質控。

2.陰性質控:需要準備確定陰性的樣品或空白對照,用于進行污染物的質控。

3.重復次數n:中國人喜歡3(三顧茅廬),6(六六大順),8(發發發),9(九九歸一),很遺憾這些數和實驗室都關系不太大。符合統計學計算的最常用的兩個數字是5和20,5通常是能進行統計學分析的最少重復次數,20通常用于計算95%的置信區間。大家根據自己的需要選擇合適的重復次數。


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常見輔料的質檢


輔料的質檢應結合實際工作中可能用到的場景,并非越苛刻越好,需要每個實驗室結合自身情況來設計和調整文中提到的參數。


1.離心管:

(1)滲漏密閉性:將n個離心管加入半量墨汁,蓋好蓋子后放入水中,浸泡30min,沒有墨汁滲出為合格。

(2)離心密閉性:將n個離心管加入半量純水,放入離心機,10000 rpm,30min,管蓋未崩開未漏液為合格。

(3)熱密閉性:將n個離心管加入半量純水,蓋好蓋子稱重后放入金屬浴中,65℃或90℃(巴氏消毒),30min,再進行稱重,離心管未變形,管蓋未崩開未漏液,前后重量未變化為合格。。

(4)冷密閉性:將n個離心管加入半量純水,放入-20℃冰箱,24h,離心管未變形,管蓋未崩開未漏液為合格。

(5)污染物質檢:將n個離心管分別加入半量陰性純水,蓋好蓋子渦旋1 min后靜置5min,吸取純水作為模板進行擴增,qPCR無擴增為合格。

(6)抑制物質檢:將n個離心管分別加入弱陽性質控物,室溫靜置5min,然后進行提取;RNA核酸,DNA核酸,室溫靜置5min,作為模板進行擴增,qPCR擴增未被抑制為合格。


2.PCR管:

(1)滲漏密閉性:將n個PCR管加入半量墨汁,蓋好蓋子后放入水中,浸泡30min,沒有墨汁滲出為合格。

(2)離心密閉性:將n個PCR管加入半量純水,放入離心機,1000 rpm,30min,管蓋未崩開未漏液為合格。

(3)熱密閉性:將n個PCR管加入半量純水,蓋好蓋子稱重后放入PCR儀,設置一個常用的PCR程序,程序運行完畢后,再進行稱重,PCR管未變形,管蓋未崩開未漏液,前后重量未變化為合格。。

(4)冷密閉性:將n個PCR管加入半量純水,放入-20℃冰箱,24h,離心管未變形,管蓋未崩開未漏液為合格。

(5)污染物質檢:將n個PCR管加入半量陰性純水,蓋好蓋子渦旋1 min后靜置5min,作為模板進行擴增,qPCR無擴增為合格。

(6)抑制物質檢:將n個PCR管分別加入弱陽性質控物,室溫靜置5min,然后進行提取;RNA核酸,DNA核酸,室溫靜置5min,作為模板進行擴增,qPCR擴增未被抑制為合格。

(7)空白熒光通透性:對于qPCR,需要考察PCR管是否有非特異性熒光信號,將n個空PCR管,蓋好蓋子后放入PCR儀,設置一個常用的PCR程序,程序運行完畢后,qPCR無擴增為合格。

(8)陽性熒光通透性:對于qPCR,還需要考察PCR管是否會抑制熒光的通透性,將n個含弱陽性樣品和擴增試劑的PCR管,與確認無熒光干擾的PCR管,蓋好蓋子后放入PCR儀一同擴增,設置一個常用的PCR程序,程序運行完畢后,qPCR擴增未被抑制為合格。


3.濾芯吸頭:測試吸頭需使用經校準的移液器

(1)準確性:將n個吸頭分別吸取定量的純水稱重,重量與體積的關系按照1 g/mL換算。

(2)氣密性:取n個吸頭,吸取最大量程的含有1%甘油的墨水,觀察有色液體不出現在濾塞之上,液面相同為合格。

(3)防氣溶膠性能:取n個吸頭,吸取陽性核酸,反復吹吸10次,換另一個新吸頭在陰性純水中反復吹吸10次,取陰性純水作為模板進行擴增,qPCR無擴增為合格。

(4)污染物質檢:取n個吸頭,吸取陰性純水反復吹吸10次,取陰性純水作為模板進行擴增,qPCR無擴增為合格。

(5)抑制物質檢:取n個吸頭,吸取弱陽性質控物反復吹吸10次,然后進行提取;吸取RNA核酸和DNA核酸反復吹吸10次,作為模板進行擴增,qPCR擴增未被抑制為合格。


4.采血管、采樣管、采樣拭子和一次性吸管等:主要考察污染物和抑制物

(1)污染物質檢:將n個耗材加入一定量陰性純水,蓋好蓋子渦旋1 min后靜置30min,吸取純水作為模板進行擴增,qPCR無擴增為合格。

(2)抑制物質檢:將n個耗材分別加入弱陽性質控物,室溫靜置30min,然后吸取質控物進行提取;作為模板進行擴增,qPCR擴增未被抑制為合格。

5.無核酸酶水、PBS等緩沖液:

(1)PH值:測量各緩沖液的PH值。

(2)污染物質檢:吸取緩沖液作為模板進行擴增,qPCR無擴增為合格。

(3)抑制物質檢:將緩沖液分別與RNA核酸和DNA核酸混合,然后吸取混合液作為模板進行擴增,qPCR擴增未被抑制為合格。


6.移液器和離心管架及離心機的內外表面:這些常見物品的外表面容易被核酸和細菌污染,主要查看這兩個指標。

(1)表面核酸污染:用沾濕的拭子擦拭上述物品的外表面,然后浸泡到純水中10min,吸取純水作為模板進行擴增,qPCR無擴增為合格。

(2)移液器內腔核酸污染:對于常用的移液器的內部,可使用無濾芯的吸頭在陰性純水中吹吸10次后,吸取純水作為模板進行擴增,qPCR無擴增為合格。

(3)表明細菌污染:用沾濕的無菌拭子擦拭上述物品的外表面,劃瓊脂平板,每個平板的菌落數不應超過一定數量(我也不確定多少合適,由于不要求無菌操作一定會有細菌,但是也不應該太多)。

非瘟和新冠后全國一下子新增了很多核酸檢測實驗室,早期大家關注的點都在設施和硬件上,但是一個檢測實驗室開展大量檢測工作之后,檢測中最弱的環節決定檢測的質量。我們也需要將精力放在檢測中的每個細節上

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